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主题:成肌细胞在基因治疗和组织工程中的应用(转贴)

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成肌细胞在基因治疗和组织工程中的应用(转贴)  发贴心情 Post By:2004/5/17 17:07:19

成肌细胞在基因治疗和组织工程中的应用

岑石强  杨志明 华西医科大学附属第一医院骨科(成都,6 10041)

  成肌细胞是指胞浆中含有肌丝的肌组织前体细胞, 包括心肌、平滑肌及骨骼肌在内的三种肌 组织,其胚胎发育都经历了由间充质细胞分化为成肌细胞,再进一步分化为成熟肌细胞的过 程。成熟个体的心肌组织与平滑肌组织都不含成肌细胞,而骨骼肌组织中的成肌细胞则是以 骨骼肌卫星细胞的形式存在[1]。哺乳动物的骨骼肌卫星细胞大约为25 μm×4 μm ×5 μm,位于肌纤维的肌膜与基底膜之间。一旦骨骼肌组织受到损伤,卫星细胞就会被激 活,大量分裂、增殖,相互融合形成再生肌纤维。围绕骨骼肌组织的再生过程已进行了大 量关于成肌细胞的研究,主要包括以下四个方面:①成肌细胞在骨骼肌组织再生过程中的重 要作用;②成肌细胞体内、体外生物学特性;③成肌细胞移植作为基因治疗的研究;④成肌 细胞与材料复合的组织工程研究。现将有关的研究结果综述如下。

1 成肌细胞与骨骼肌组织再生

  正常情况下,骨骼肌卫星细胞具有一定分裂、增殖能力,卫星细胞的数目不会 随时间增加 而增加。因为分裂产生的成肌细胞会融合入邻近的肌纤维中,使肌纤维细胞核增加,可达数 百个,同时使肌纤维增粗、变长,完成肌纤维的发育。一旦骨骼肌受到损伤,不论损伤形式 如何,如冻伤、缺血损伤或某些遗传性肌病导致的病理损伤,骨骼肌的再生过程都是大致相 同的[2]。首先是受损肌纤维出现不同程度坏死,然后在受累区域出现巨噬细胞清 除坏死肌纤维,但保留坏死肌纤维周围的基底膜。同时,卫星细胞会被大量激活,在伤后1 周内迅速分裂、增殖,数量达到高峰。之后仍维持一定的分裂能力,但数量却逐渐减少。减 少的卫星细胞沿着残留的基底膜在原肌纤维(已被清除)部位,相互融合,成为肌小管。肌 小管不断接受新生的成肌细胞,或者与相邻肌小管互相融合而逐渐长大,同时肌小管能合成 肌原纤维,这就是幼稚的肌纤维。在局部微环境调节下,幼稚肌纤维逐渐成熟。肌肉再生的 启动环节在于卫星细胞被激活,以及激活的卫星细胞在短时间内迅速大量分裂增殖的能力。 Cantini等[3]发现肌组织受伤后的48小时,受损区内巨噬细胞数量达到高峰,较卫 星 细胞大量增殖的峰时(3天)早,认为巨噬细胞能激活卫星细胞。从大鼠无菌性腹膜炎经腹 腔灌洗而获得的含大量巨噬细胞的腹腔渗出液加入大鼠成肌细胞原代培养物中,发现巨 噬细胞与成肌细胞混合培养能明显提高成肌细胞有丝分裂及分化融合形成肌小管的能力。 说明巨噬细胞一方面担负清理坏死肌纤维的功能,另一方面负责分泌一种选择性刺激成肌 源性细胞增殖、分化的因子,启动再生形成肌纤维的过程。

  受损骨骼肌再生主要取决于三个方面:①基底膜的完整性;②受损肌肉的血供重建;③ 受损肌肉的神经支配。当受损肌肉肌纤维被巨噬细胞清理后,外周的基底膜能保留下来,就 像许多中空、“管道”样的支架。“管道”样的微环境能充分诱导再生肌纤维分化,并沿原 先肌纤维的方向排列。在骨骼肌冻伤的动物模型中,受损肌组织的基底膜结构完整,能充分 诱导再生过程。在挫裂伤的情况下,基底膜的排列、结构均不可避免地受到损伤,其再生 必然是不完全和无序的。

  1980年Hansen-Smith和Carlson等研究游离大鼠趾长伸肌原位缝合(无血管吻合)后整 块肌肉的再生过程。缝合后第1天,整块肌肉均处于缺血状态,仅在肌肉较表浅处可残留一 些肌纤维,大量卫星细胞通过渗透作用,由邻近组织获得营养。在肌肉中心部位,肌纤维坏 死,但卫星细胞则因趋化作用迁移到周边部位而存活[4]。第2 天有窦状毛细血管由 周 边正常组织长入,直到第7天,能达到肌肉中心部位。在第1周内,坏死中心逐渐缩小、吸收 ,再生的组织随着血供的恢复向中心推移。一般在3~5天可见带横纹的再生纤维。第10天, 绝大部分肌肉均由再生的较细小肌纤维组成,肌纤维再生已达完全。同时可见神经纤维再生 ,一般在3~4周后才有神经纤维长入。到60天时,肌梭形成。显然,神经再生滞后于肌纤维 再生。大多数情况下,再生肌纤维若得不到良好的神经调控会自发萎缩,由脂肪、成纤 维细胞所代替。

2 成肌细胞体外培养及生物学特性研究

 目前,成肌细胞培养多采用胰酶、胶原酶分步消化分离出单个成肌细胞[5, 6],通 过差速贴壁法去除混杂的成纤维细胞[7],再进行单层细胞培养。1981年Blau等发 现 胚胎来源的成肌细胞每一个都能分裂倍增60~70次,成熟个体来源的成肌细胞也能分裂倍增 45次。若每次取0.3 cm3组织进行酶消化培养,能获得大约5×10 3个有分裂能力的卫星 细胞,产生5×1010个成肌细胞,相当于1 g成肌细胞,足以进行各种细胞移植或组织 工程的相关研究。

  经酶消化分离的成肌细胞为球形,贴壁后绝大多数为梭形,少数有突起,为不规则状。营 养条件良好,如培养基中加入15%~20%的动物血清(即生长培养基),成肌细胞以分裂、 增殖为主。一旦成肌细胞长满整个培养瓶,相互接触时,增殖将明显受到抑制,表现为相邻 成肌细胞相互融合,形成肌小管,即表现出分化倾向。降低培养液中营养条件,如动物 血清不超过5%(即融合培养基),能明显促进分化,使单位数目的成肌细胞形成肌小管的百分 比增加。初始形成的肌小管的多个细胞核沿细胞中心轴线排列,形成中心核链,而合成的少 量肌原纤维则位于周边。随着分化的继续,肌原纤维大量生成,逐渐占据细胞中心部位,迫 使中心核链的核移向周边,即形成幼稚肌纤维,此时,经特殊染色可见到横纹。体外 培养成肌细胞,观察其增殖与分化过程,即为体内骨骼肌发育或再生初始阶段的翻版。深入 了解体外的分化过程,能更好地调控对应的体内过程。

  除上述特殊表现外,成肌细胞在培养条件良好时,能形成有收缩能力的幼稚肌纤维也是其特 点之一。成肌细胞能合成骨骼肌特异的磷酸肌酸激酶CK-MM亚型,且含有肌动蛋白 与肌球蛋白及其前体蛋白等收缩蛋白,均能通过生物化学或免疫化学方法鉴定。

3 成肌细胞移植与基因治疗

  成肌细胞移植较早用于某些遗传性肌病的基因治疗[8]。如杜兴肌营养不良症( Duchenne muscular dystrophy, DMD),患者肌细胞缺少编码dystrophin这种膜下蛋白的基 因[9],细胞膜不稳定,最终导致肌纤维坏死,患者常死于呼吸衰竭。肌营养不良 有 对应的动物模型(muscular dystrophy murine mice, MDX),这种小鼠位于 X染色体上的dyst rophin基因发生点突变后,不具备生成dystrophin的能力,肌纤维坏死程度比人类轻。大量 的成肌细胞移植治疗肌营养不良症的动物实验均在此模型上进行。

  成肌细胞在活体内能融入邻近肌纤维中,这是正常肌纤维生长或受损肌纤维再生的基本反 应。将正常成肌细胞移植到MDX小鼠的骨骼肌肉组织后,能与宿主(MDX小鼠)的肌纤维融 合,形成杂交肌纤维。进行dystrophin特异性免疫组织化学染色时,正常骨骼肌纤维呈阳性 ,MDX小鼠肌纤维呈阴性,而杂交肌纤维则呈阳性[10]。说明正常成肌细胞能与MDX 小鼠的肌纤维融合并表达其基因产物棗dystrophin。Law等[11,12] 将成肌细胞 移植用于治疗DMD,这是人类基因治疗较早期的临床试验。虽然部分病例有短时期、较 好的临床效果,但其总体疗效不令人满意。究其原因,免疫排斥反应是最重要的障碍[ 13]。进一步研究发现,成肌细胞一旦融入肌纤维中就不表达Ⅰ类主要组织相容性复合体 (major histocompatibility complex class Ⅰ, MHC-Ⅰ)抗原。如果提高所移 植成肌细胞的融合能力(如纯化所培养的成肌细胞)可减少宿主免疫系统对移植细胞的攻击 。Fang等[14]分离出MHC-Ⅰ抗原阴性的成肌细胞系,他们发现 MHC-Ⅰ抗原阴性 的成肌细胞体外增殖与分化能力与MHC-Ⅰ抗原阳性的成肌细胞无差别。因此,有理由相信M HC-Ⅰ阴性成肌细胞移植将是治疗遗传性肌病的有效途径。

  成肌细胞是哺乳动物体内唯一能大量分裂、增殖及迁移的前体细胞,具有与宿主肌纤维融合 的能力,可作为一种有效载体广泛用于目的基因的转移。目前已经通过基因工程获得能表达 人类Ⅸ因子(human factor Ⅸ, hF Ⅸ)[15~19]、红细胞生成素(erythropoietin, EPO)[20,21]及克隆形成刺激因子(clony stimulating facto r-1, CSF-1) [22,23]等基因产物的成肌细胞株。将这些基因工程化的成肌细胞移植到对应疾病 的动物模型后,均能在受者的外周血中测得相应的基因产物。

4 成肌细胞在组织工程中的应用展望

  到目前为止,关于成肌细胞与材料复合研究得最多的是成肌细胞与Ⅰ型胶原凝胶复合。最 初研究发现,Ⅰ型胶原能促进成肌细胞贴壁,而且在体外能很好地促进成肌细胞分化,使成 肌细胞融合的百分比增加。成肌细胞、肌 小管或肌纤维都是长条形,具有极性,组织中的肌纤维排列具有很强的方向性,因此成肌细 胞在组织工程方面的应用具有一定难度。Okano等[24,25]将成肌细胞混合 于Ⅰ型胶原溶液中,并置于37℃孵箱内,形成含成肌细胞的Ⅰ型胶原凝胶。在凝胶过程中 ,根据不同的模型铸成盘状、管状或片状结构。体外培养发现成肌细胞仍能在凝胶铸形中分 化形成肌小管。如果施加周期性应力,管形结构的胶原与成肌细胞能沿管的轴线排列。这些 体外合成的成肌细胞-胶原凝胶可用于各种实体软组织或血管的修补与替代。

基金项目:国家自然科学基金资助项目(39870202)

5 参考文献

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 4  Schultz E, Albright DL, Jaryszak DL, et al. Survival of sat ellite cells in whole muscle transplants . Anat Res, 1988;222:12

 5  Rando TA, Blau HM. Primary mouse myoblasts purification, ch aracterization and transplantation for c ell-mediated gene therapy. J Cell Biol, 1 994;125:1 275

 6  Roy R, Dansereau G, Tremblay JP, et al. Expression of major histocompatibility complex antigens on h uman myoblasts. Transplant Proc, 1991;2 3(1):799

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 11  Law PK, Goodwin T, Fang Q, et al. Whole body myoblast transfer. Tr ansplant Proc, 1994;26(6):3 381

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中国修复重建外科杂志


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